Chromatographie sur Couche Mince (CCM): Protocole, Principe et Fonctionnement
La chromatographie sur couche mince (CCM) est une des principales méthodes chromatographiques utilisées dans les laboratoires. C'est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire. Cette technique est fiable et rapide, ce qui explique son emploi très fréquent dans les laboratoires.
1. Principe de la CCM
La CCM est une chromatographie dans laquelle les solutés restent en contact avec la phase mobile et la phase stationnaire durant la même période de temps. Ils parcourent différentes distances en fonction de leurs interactions avec les deux phases; c’est la migration différentielle.
Certaines molécules peuvent se fixer momentanément à la surface de particules solides : c'est le phénomène d'adsorbance ; le solide est appelé adsorbant. Lorsqu'on fait circuler ces molécules à travers un adsorbant, leur vitesse de déplacement est d'autant plus faible que l'adsorbance est plus forte : des molécules d'adsorbances différentes vont donc se déplacer à des vitesses différentes et vont ainsi pouvoir être séparées. Les molécules sont entraînées par un gaz ou un liquide appelé éluant. La vitesse d'entraînement des molécules dépend aussi de leur affinité avec l'éluant.
1.1 Interactions Moléculaires
Les interactions de type liaison hydrogène jouent un rôle décisif lors de la migration des composés. On peut distinguer :
- Liaison hydrogène (1)
- Donneur d'hydrogène (D)
Moins les composés sont polaires (ou apolaires (A)), plus ils ont de facilité à être emmenés dans la phase mobile.
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2. Matériel et Méthode
La technique présentée ici utilise une phase stationnaire déposée sur une plaque d'aluminium. La phase mobile est entraînée par capillarité (c’est la migration différentielle. d'ascension d'un liquide) vers le haut de la plaque.
2.1. Phase Stationnaire (Support)
La plaque chromatographique est en général constituée de deux parties : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice, fixée à une plaque rigide en aluminium (c'est le cas ici), en plastique ou parfois en verre. Il existe trois principaux supports : silice, alumine et cellulose.
- Silice : C'est le support le plus courant.
- Alumine : A caractère basique.
- Cellulose : Pour séparer les composés polaires, comme les sucres ou les acides aminés.
Le support à choisir est la silice. Il est conseillé de toujours commencer par celui-là.
2.2. Phase Mobile (Éluant)
Le choix de l'éluant est essentiel. L'éluant utilisé doit être adapté aux composés à séparer. On a vu que le choix dépendait de la polarité.
2.3 Préparation de la Cuve
On utilise un récipient haut (par exemple un becher) appelé "cuve" au fond duquel on verse une faible quantité d'éluant. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci.
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On place contre les bords de la cuve un morceau de papier filtre : l'éluant va monter par capillarité et assurera ainsi une meilleure saturation de la cuve. La saturation est nécessaire pour éviter l'évaporation de l'éluant pendant son ascension le long de la plaque. Rajouter un peu d'éluant si cela semble nécessaire.
Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve.
3. Protocole Expérimental
3.1 Préparation de la Plaque
Sur une "plaque" constituée d'un support sur lequel est déposé l'adsorbant, adapté à la dimension de la cuve, on dépose une micro-goutte du corps à étudier et éventuellement des réactifs de référence.
Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque (environ 1,5 cm du bas de la plaque), sans appuyer et sans y laisser ses empreintes. ATTENTION : NE PAS APPUYER POUR CONSERVER INTACT L'ADSORBANT. Ce trait (ligne de base) servira de repère pour déterminer les longueurs de migration; Marquer délicatement deux, trois ou quatre points sur la ligne de base, qui serviront à repérer la position des dépôts du mélange d'huiles essentielles et des solutions de référence.
3.2 Dépôt des Échantillons
L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant.
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On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches. Laisser sécher la plaque et recommencer 4 ou 5 fois de manière que la quantité de colorant soit suffisante.
Chaque dépôt doit révéler le maximum d'information. Dans un angle de la plaque, on réalise la tache.
3.3 Développement de la CCM
Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. Attention à ne pas mettre les bords latéraux de la plaque en contact avec la cuve : l'éluant monterait inégalement le long de celle-ci. Couvrir chaque cuve pour éviter l'évaporation de l'éluant. NE PLUS DEPLACER LA CUVE JUSQU'A LA FIN DE L'ELUTION. Placer la plaque au milieu de la cuve, en appui sur le bord supérieur, en veillant à ce qu'elle ne touche pas les parois verticales.
Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. L'éluant monte par capillarité dans l'adsorbant, entraînant les différents composants à des vitesses différentes.
Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque (environ 1 cm du bord supérieur), on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu. SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l'éluant. d)Marquer rapidement au crayon le front du solvant (le méthanol s'évapore très vite).
4. Révélation des Taches
La plupart des composés sont incolores, il faut donc les révéler. Les huiles essentielles n'étant pas colorées, n'apparaissent pas sur la plaque : on doit utiliser un révélateur afin de repérer leur migration.
4.1 Observation sous UV
Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. On place la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorés.
4.2 Révélation à l'Iode
Les taches apparaissent en jaune-marron en présence d'iode. On place la plaque et quelques cristaux d'iodes, puis boucher.
4.3 Révélation Chimique
On utilise une solution de permanganate de potassium en solution (les taches apparaissent noires). On peut aussi utiliser une solution de molybdate de sodium et de sulfate de cérium. Il faut éviter toute formation de goutelettes. Le réactif est appliqué en plusieurs pulvérisations.
5. Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Le rapport frontal, habilement traduit comme Rapport frontal, est le rapport de la distance parcourue par le composé sur la distance parcourue par le front de solvant. Il permet de comparer les résultats obtenus avec différents éluants et différents supports donnés.
6. Applications de la CCM
La CCM peut être utilisée pour :
- Séparation des couleurs d'un feutre.
- Identification des acides aminés de l'aspartame.
- L'hydrolyse d'une protéine.
- L'extraction et la chromatographie des colorants d'une feuille de Prunus.
- L'extraction et la chromatographie d'huiles essentielles de feuilles Menthe poivrée.
On observe dans le cas des colorants la présence de deux taches, l'une située à la même hauteur que la tache issue du dépôt de tartrazine seule, l'autre correspondant au bleu patenté V. On réalise la même expérience avec le benzaldéhyde non coloré. On utilise une plaque de silice spéciale imbibée d'un agent qui devient fluorescent sous une radiation de longueur d'onde de 254 nm. On observe ici deux taches, indiquant que le benzaldéhyde n'est pas pur.
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