Comment Faire une Chromatographie sur Couche Mince : Protocole Détaillé
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile, qui entraîne les composés, et la phase stationnaire. La technique présentée ici est la chromatographie sur couche mince (CCM). Ceci explique son emploi très fréquent dans les laboratoires. Nous avons vu que la technique de CCM est une technique fiable et rapide. La CCM est une chromatographie dans laquelle les solutés restent en contact avec la phase mobile et la phase stationnaire durant la même période de temps. Ils parcourent différentes distances en fonction de leurs interactions avec les deux phases.
1. Préparation de la Cuve et de l'Éluant
Introduire l'éluant jusqu'à une hauteur d'environ 0,5 cm dans la cuve à chromatographie, puis la fermer. Les vapeurs d'éluant vont alors saturer la cuve. On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci. La phase stationnaire s’équilibre avec la phase vapeur par l’adsorption de celle-ci jusqu’à saturation. Si la phase stationnaire est une silice vierge, les vapeurs des solvants polaires sont plus fixées que celle des solvants apolaires.
2. Préparation des Échantillons
Si les composés à analyser sont sous forme solide, les dissoudre dans un minimum de solvant. L'étape importante de cette manipulation est le dépôt des espèces chimiques sur la plaque. On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque. Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser. Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches.
3. Développement de la Plaque
Tracer au crayon un trait à 1 cm du bas de la plaque. On trace un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes. Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts. SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur. Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu.
4. Visualisation et Révélation des Composés
Retirer la plaque et tracer rapidement au crayon à papier un trait indiquant la hauteur atteinte par l'éluant. La plupart sont incolores. Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. On entoure au crayon. On utilise une plaque de silice spéciale imbibée d'un agent qui devient fluorescent sous une radiation de longueur d'onde de 254 nm. On observe ici deux taches, indiquant que le benzaldéhyde n'est pas pur.
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5. Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Le transfert vers la chromatographie sur colonne impose de raisonner en volume de phase mobile nécessaire pour éluer les analytes.
6. Applications Avancées
Dans un angle de la plaque, on réalise la tache. On laisse éluer dans un premier éluant. éluant. On obtient alors une cartographie de la protéine.
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