Identification par Chromatographie sur Couche Mince: Principe et Applications
La chromatographie d'adsorption est une technique de séparation de composés basée sur la différence d'affinité existant entre ces composés, la phase mobile et la phase stationnaire. La technique présentée ici est la chromatographie sur couche mince (CCM).
Principe de la CCM
La CCM est une chromatographie dans laquelle les solutés restent en contact avec la phase mobile et la phase stationnaire durant la même période de temps. Ils parcourent différentes distances en fonction de leurs interactions avec les deux phases.
Phase Stationnaire
Elle utilise une phase stationnaire déposée sur une plaque d'aluminium. La plaque chromatographique est en général constituée de deux parties : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice, fixée à une plaque rigide en aluminium (c'est le cas ici), en plastique ou parfois en verre.
Il existe trois principaux supports : silice, alumine et cellulose. La silice est le support le plus courant. Si la phase stationnaire est une silice vierge, les vapeurs des solvants polaires sont plus fixées que celles des solvants apolaires.
Phase Mobile (Éluant)
La phase mobile est entraînée par capillarité vers le haut de la plaque. L'éluant utilisé doit être adapté aux composés à séparer. Le choix de l'éluant est essentiel et dépend de la polarité des composés à séparer.
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Protocole Opératoire
- On place environ 10 mL d'éluant dans la cuve à chromatographie, afin d'avoir un demi centimètre d'éluant au fond de celle-ci.
- On trace un trait au crayon de papier à environ 1,5 cm du bas de la plaque, sans appuyer et sans y laisser ses empreintes.
- On dépose à l'aide d'un capillaire les espèces à séparer, diluées dans un solvant, si possible identique à l'éluant ou suffisamment volatil, au niveau de la ligne de dépôt en réalisant des dépôts séparés de 1 à 2 cm entre eux et du bord de la plaque.
- Il est important de ne pas appuyer le capillaire sur la plaque afin de ne pas la creuser.
- Il est possible de répéter le dépôt plusieurs fois afin d'augmenter la quantité d'espèces chimiques déposées sans élargir les taches.
- Placer verticalement la plaque dans la cuve, et la refermer rapidement. Au départ, l'éluant ne doit pas toucher les dépôts.
- SANS BOUGER LA CUVE, attendre que l'éluant soit arrivé à environ 1 cm du bord supérieur.
- Lorsque le front de solvant arrive à deux centimètres du haut de la plaque, on la retire et on repère immédiatement par un trait ce front, afin d'indiquer l'endroit où l'éluant est parvenu.
La taille des plaques de CCM est conditionnée par les dimensions de la cuves. Les pots de "Blédine", présentant un rebord sur lequel on peut appuyer le haut de la plaque, permettent d'éviter les contacts avec les bords de la cuve.
Révélation des Taches
Les huiles essentielles n'étant pas colorées, n'apparaissent pas sur la plaque : on doit utiliser un révélateur afin de repérer leur migration.
Méthodes de révélation
- Observation sous UV : Les dérivés aromatiques absorbent dans l'UV. Placer la plaque sous une lampe UV et entourer les taches colorées.
- Iode : Les taches apparaissent en jaune-marron en présence d'iode. Placer la plaque et quelques cristaux d'iode, puis boucher.
- Pulvérisation de réactifs : Utiliser des réactifs comme la vanilline sulfurique ou le molybdate de molybdène en présence de sulfate de cérium.
Calcul du Rapport Frontal (Rf)
Le rapport frontal (Rf), habilement traduit comme Rapport frontal, est un rapport entre la distance parcourue par le composé et la distance parcourue par le solvant sur un support donné.
Formule: Rf = Distance parcourue par le composé / Distance parcourue par le solvant
Applications de la CCM
Nous avons vu que la technique de CCM est une technique fiable et rapide. Ceci explique son emploi très fréquent dans les laboratoires. Elle est utilisée pour :
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- Séparation des couleurs d'un feutre.
- Identification des acides aminés de l'aspartame.
- L'hydrolyse d'une protéine.
- L'extraction et la chromatographie des colorants d'une feuille de Prunus.
- L'extraction et la chromatographie d'huiles essentielles de feuilles de Menthe poivrée.
Exemples d'Applications Spécifiques
Extraction et chromatographie des colorants d'une feuille de Prunus
Pour cette application, il est essentiel de suivre un protocole précis :
- Placer 4 feuilles de Prunus dans un mortier contenant environ 5ml de méthanol, utilisé comme solvant.
- Marquer un trait fin au crayon à 1cm de l'un des petits côtés de chaque plaque (ligne de base).
- Déposer par capillarité une goutte du filtrat au milieu du trait précédemment marqué. Laisser sécher et recommencer 4 ou 5 fois.
- Placer dans chaque cuve une plaque de chromatographie et couvrir chaque cuve pour éviter l'évaporation de l'éluant.
- Marquer rapidement au crayon le front du solvant. Laisser sécher la plaque puis repérer les fronts des différents colorants.
- Calculer les rapports frontaux Rf des différents colorants pour chaque plaque et donner votre conclusion quant à l'utilisation des deux éluants.
Extraction d'huiles essentielles de feuilles de Menthe poivrée
La menthe poivrée a été choisie car l'extraction produit une quantité importante d'huiles essentielles, ce qui facilite la séparation des deux phases. La qualité des chromatographies repose sur la bonne dilution des huiles essentielles. Il faut respecter les dilutions indiquées dans la mesure où on dispose du matériel nécessaire (micropipettes).
| Composant | Importance |
|---|---|
| Menthol | Principal |
| Menthone | Important |
| Cinéole | Important |
| Autres | Au moins six composants |
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